miRNA-mRNA差异表达与卵巢癌多药耐药关系的研究

【摘要】卵巢癌在女性生殖道恶性肿瘤发病率中占第三位，但是死亡率高居第一。化疗是治疗卵巢上皮癌重要手段之一，但多药耐药的产生又是导致化疗失败的中心环节。卵巢上皮癌多药耐药机制十分复杂，目前研究认为可能涉及肿瘤细胞内化疗药物的外排、DNA损伤与修复、细胞凋亡异常和信号传导通路障碍等分子机制，但是至今仍未找到安全有效的逆转耐药靶点。本研究拟通过运用miRNA芯片技术和基因芯片技术，以及生物信息学等多样化研究手段，从临床到基础研究，然后回归临床的研究桥梁，阐述卵巢上皮癌多药耐药分子机制，为寻找安全有效的逆转卵巢上皮癌多药耐药治疗靶点提供理论基础。研究目的：筛选卵巢上皮癌多药耐药相关miRNA表达谱。材料和方法：采用AgilentmiRNA芯片，检测5例卵巢上皮癌耐药组织、5例敏感组织、5例卵巢良性肿瘤和5例正常卵巢组织的miRNA表达情况，运用Fc差异倍数，获得了卵巢上皮癌耐药组和敏感组差异大于2倍的上调或下调miRNA。用多个在线软件分别预测上调和下调差异miRNA对应的靶基因，并运用GO分析和Pathway通路富集等生物信息学方法分析预测到的靶基因潜在的生物学功能和参与的信号通路。用QRT-PCR验证芯片结果，并扩大样本量检测目的miRNA的表达情况，并分析miRNA表达水平与临床病理因素关系。结果：miRNA芯片筛选出与卵巢上皮癌多药耐药相关的差异表达miRNA共62个，其中有42个miRNA在卵巢上皮癌耐药组织中上调、20个miRNA下调，上调miRNA预测到1391个靶基因，下调miRNA预测到1231个靶基因。GO分析结果显示：上调表达的miRNA预测到的靶基因主要参与了细胞蛋白质代谢过程和RNA聚合酶II启动子的转录调控过程，下调表达的miRNA预测的靶基因主要参与转录调控、蛋白酶参与的细胞蛋白质分解代谢过程以及细胞蛋白质分解代谢等过程。KEGGPathways通路分析提示上调表达的miRNA预测的靶基因主要参与TGF-beta信号通路和粘着连接信号通路。疾病富集分析部分靶基因与卵巢上皮癌或卵巢肿瘤相关。QRT-PCR验证miRNA芯片结果，差异表达的miR-200a-3p、miR-382-5p、miR-1、miR-152和miR-299-5p与芯片表达趋势一致，扩大临床样本验证亦得到了一致的结果，其中miR-200a-3p在卵巢癌耐药组织中下调0.31倍，差异有统计学意义（P＜0.01）；miR-382-5p、miR-152和miR-299-5p分别上调3.53倍、2.69倍和2.70倍，差异有统计学意义（P＜0.01）；miR-1上调1.14倍，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：我们通过miRNA芯片技术筛选出了跟卵巢上皮癌耐药相关miRNA表达谱，同时靶基因预测提示我们一个miRNA可以调控多个靶基因，而一个靶基因又可能同时受几个miRNA的调控，可见miRNA的调控机理是十分复杂的。生物信息学分析提示差异表达miRNA预测到的靶基因广泛参与多个生物学过程，我们可以推测这些异常表达的miRNA可能通过调控特定功能的靶基因，参与重要信号传导通路，在肿瘤的生长及肿瘤耐药产生过程中发挥重要角色。后期需要进一步研究以认识这些差异miRNA参与卵巢上皮癌耐药发生的相关分子机制。研究目的：筛选卵巢上皮癌多药耐药相关mRNA表达谱。材料和方法：采用AgilentlncRNA芯片，检测5例卵巢上皮癌耐药组织、5例敏感组织、5例卵巢良性肿瘤和5例正常卵巢组织的mRNA表达情况，获得与卵巢上皮癌耐药组和敏感组差异大于2倍的上调或下调mRNA。运用GO分析和Pathway通路富集等生物信息学方法分析差异表达mRNA潜在的生物学功能和参与的信号通路。用QRT-PCR验证芯片结果，并扩大样本量检测目的mRNA的表达情况，并分析mRNA表达水平与临床病理因素关系。结果：mRNA芯片筛选出于卵巢上皮癌多药耐药相关差异表达mRNA共855个，其中在卵巢上皮癌耐药组织中上调表达的mRNA598个，下调表达的257个。生物信息学分析结果显示上调mRNA主要参与细胞粘附、生物黏附、调节细胞增殖、免疫反应以及血管发育等31个生物学过程，下调mRNA未富集到显著相关生物学过程。KEGGPathway分析结果显示上调mRNA主要参与了粘着斑和ECM-受体相互作用的信号传导途径。QRT-PCR验证芯片结果，KIT、HGF、CSF1R、PDGFRB和KIAA1804与芯片表达趋势一致，扩大临床样本验证亦得到了一致的结果，其中KIT、HGF、CSF1R、PDGFRB基因在EOC耐药组织中分别上调3.81倍、2.74、2.03倍和2.92倍，差异有统计学意义（P﹤0.05），而KIAA1804基因则下调0.42倍，差异有统计学意义（P﹤0.05）。结论：利用基因芯片基础筛选出了跟卵巢上皮癌多药耐药相关的mRNA表达谱，丰富了目前已知的跟耐药相关的靶基因数据。生物信息学提示差异表达mRNA多参与细胞粘附、调节细胞增殖、免疫反应等生物学过程，以及部分mRNA被富集在粘着斑和ECM-受体相互作用的信号通路上，提示这些差异基因可能通过多种途径参与卵巢上皮癌多药耐药的发生，后期需要进一步研究以认识这些差异miRNA参与卵巢上皮癌耐药发生的相关分子机制。研究目的：构建与卵巢上皮癌多药耐药相关miRNA-mRNA调控网络。材料和方法：对筛出的卵巢上皮癌多药耐药相关的miRNA差异表达谱和mRNA差异表达谱信息运用MAGIA软件进行整合分析，并选取miRNA跟mRNA负相关的miRNA-mRNA，构建卵巢上皮癌耐药相关miRNA-mRNA调控网络图，并用QRT-PCR方法验证关键位点miRNA和mRNA的表达，并分析miRNA-mRNA表达水平与临床病理因素关系。结果：miRNA表达谱和mRNA表达谱关联后，共得到53对负关联的miRNA/miRNA，其中包括10个miRNA和43个mRNA，被富集到的靶基因最多的是miR-429和miR-381，对应靶基因数目分别为16个和8个，而被最多miRNA关联调控的mRNA分别是ERBB4、PRKCE和PPP1R9A，印证了一个miRNA调控多个靶基因，而一个靶基因可受到多个miRNA调控。扩大临床样本QRT-PCR验证结果：相比于卵巢癌敏感组，miR-429、miR-373-5p在卵巢耐药组中分别下调0.35倍和0.39倍，差异有统计学意义（P＜0.01）；对应靶基因KANK2、ZEB2和CTSD分别上调2.56倍、3.15倍和1.89倍，差异有统计学意义（P＜0.05）；miR-381、miR-495和miR-410在耐药组中分别上调2.36倍、2.46倍和2.42倍，差异有统计学意义（P＜0.01）；对应的靶基因ERBB4、TIAL1、FGFRL1和MPPED2分别下调0.46倍、0.38倍、0.29倍和0.43倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：经过QRT-PCR验证以及文本挖掘，我们认为构建与卵巢上皮癌多药耐药相关的miRNA-mRNA调控网络图比较可靠，提示了在卵巢癌耐药组织中miRNA和mRNA复杂的调控网络关系，亦从多基因多靶点角度阐述了卵巢上皮癌多药耐药的发生机制。而关键位点的miRNA及其负调控mRNA具体以何种方式和途径参与EOC多药耐药机制的发生，需要后期做进一步深入的功能学研究，以期找到确实可靠的逆转卵巢上皮癌MDR被关键靶点，指导临床更好得防治卵巢上皮癌多药耐药的发生，提高患者预后和生活质量。
【作者】刘玲；
【导师】李力；
【作者基本信息】广西医科大学，肿瘤学，2014，博士
【关键词】卵巢上皮癌；多药耐药；分子机制；化疗；微小RNA芯片；靶基因；基因芯片；生物信息学；microRNA；负调控；

【参考文献】
[1]王曼.NTR1和PPP1R1B基因多态性与精神分裂症认知功能损害的关联研究[D].中南大学,临床医学,2014,博士.
[2]彭程.文化技术经济问题研究[D].北京交通大学,2013.
[3]詹仪.初中物理课堂成就目标定向对学习成败归因的影响[D].曲阜师范大学,课程与教学论,2004,硕士.
[4]侯中彦.中国卷烟工业企业提高ERP应用成功率的研究[D].湘潭大学,2005.
[5]孙菲菲.江苏省农村居民食物消费与营养研究[D].南京农业大学,农业经济管理,2012,硕士.
[6]陆谊.基于WebGIS的企业大气污染物查询分析系统的设计与实现[D].苏州大学,计算机应用技术（专业学位）,2013,硕士.
[7]张少坤.金属玻璃复合材料界面变形行为及断裂的数值模拟[D].燕山大学,工程力学,2014,硕士.
[8]孙玉伟.TCP协议在卫星信道中的应用研究[D].西安电子科技大学,电子与通信,2009,硕士.
[9]姚行正.贵州岩溶景区旅游开发、管理与国际接轨模式研究[D].贵州师范大学,2004.
[10]张波,汤明慧,袁剑,吴磊.负载型ZrO_2催化苯甲醛Meerwein-Ponndorf-Verley反应中的载体效应(英文)[J].催化学报,2012,06:914-922.
[11]袁辅恩.日本水利工程建设投资如何分摊[J].水利天地.1991(04)
[12]徐谊,何英,杨艳芳.磁诱导三维拓扑绝缘体波导中的导模[J].光子学报,2013,05:564-569.
[13]周雷宇.生物质催化热解制取生物油及其性能实验研究[D].南京师范大学,热能工程,2012,硕士.
[14]陈凯玲.品德课教材中公民宪法义务的文本研究[D].南京师范大学,德育学,2012,硕士.
[15]刘立柱.安·兰德与客观主义奠基[D].吉林大学,外国哲学,2013,硕士.
[16]马瑞贤.舰船柔性舵流噪声产生机理研究[D].哈尔滨工业大学,动力机械及工程,2014,硕士.
[17]赖虹.我国国有垄断企业第三类代理成本问题探讨[D].江西财经大学,会计学,2013,硕士.
[18]赵春艳.新世纪以来日本政治大国战略的实践及其对中日关系的影响研究[D].兰州大学,国际关系,2013,硕士.
[19]马溢澳.拓跋鲜卑的“中国”认同[D].吉林大学,专门史,2014,硕士.
[20]潘一峰.沪市上市公司多元化经营战略与企业绩效关系之实证研究[D].浙江大学,2004.
[21]李钰娟.以兴趣为引导的初中文言文教学策略[D].河北师范大学,学科教学,2013,硕士.
[22]韩晓娟.穿龙薯蓣多糖提取工艺及药理活性初步研究[D].东北师范大学,生物化学与分子生物学,2012,硕士.
[23]祝军.从跨文化交际学的角度探讨英汉动物词汇文化内涵的异同与翻译[D].华中师范大学,应用语言学,2003,硕士.
[24]邓继新,韩德华,王尚旭.未固结砂岩地震弹性性质的岩石物理模型表征研究[J].石油地球物理勘探,2010,02:248-253+320+160.
[25]李翔,陈增强,袁著祉.混沌机制在T-S模型模糊神经网络的系统辨识研究[J].控制与决策,2001,04:504-506.
[26]孙汉峰,柳希泉.打捆机定位控制的软件实现[J].冶金自动化,2001,01:45-47.
[27]丁涛平,王剑.数字轨道地图描述方法研究及通用轨道模型设计[J].铁道通信信号,2014,07:1-5.
[28]谭嘉恩.对债券利率风险分析工具的探索性改良[D].广东外语外贸大学,区域经济学,2013,硕士.
[29]李佳骏.防盗电子标签检测技术研究[D].杭州电子科技大学,检测技术与自动化装置,2013,硕士.
[30]钱美玲.主体性德育模式在高校创业教育中的建构研究[D].华中师范大学,思想政治教育,2013,硕士.
[31]陈松柏.多模射频（RF）接收机中开关电流（SI）∑-△调制器研究[D].湖南大学,电工理论与新技术,2012,硕士.
[32]付瑶.单纯而又丰厚的艺术世界[D].华中师范大学,比较文学与世界文学,2013,硕士.
[33]程晨.重组短杆菌源胆固醇氧化酶在E.coli中表达与亲和纯化的研究[D].江南大学,生物化学与分子生物学,2012,硕士.
[34]杜立新.河北昌黎县沿海地区地热资源评价和开发利用研究[D].中国地质大学（北京）,水利工程,2014,硕士.
[35]朱朋飞.基于TBS的高速列车转向架变型设计系统开发[D].西南交通大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[36]孙春阳.MRI新技术在新生儿缺氧缺血性脑病预后评价中的应用[D].广州中医药大学,影像医学与核医学（专业学位）,2013,硕士.
[37]周自平.电子皮带秤自动给料[J].冶金自动化,1980,05:17-22.
[38]陈英群.知识服务的主要特征及其发展趋势[J].河南图书馆学刊,2002,06:41-44.
[39]姚利娟.概念图策略下的高中数学教学实践研究[D].杭州师范大学,学科教学（专业学位）,2011,硕士.
[40]记者桂运安.中科大发现新型二维晶体材料[N].安徽日报,2014-03-11002.
[41]郭晓慧.广播媒体监督新模式研究[D].东北师范大学,新闻学,2012,硕士.
[42]孙洪伦.开磷企业（2000-2015）战略管理研究[D].中南大学,采矿工程,2004,硕士.
[43]魏丽东.主拱圈体外预应力加固试验研究[D].重庆交通大学,建筑与土木工程,2012,硕士.
[44]彭峰.成品油销售企业竞争力研究[D].西安理工大学,企业管理,2004,硕士.
[45]崔智皓.基于Web的日常生产调度系统的设计与实现[D].东北石油大学,计算机技术（专业学位）,2013,硕士.
[46]程海明.仿真合成毛发纤维的工艺设计[D].东华大学,材料工程（专业学位）,2014,硕士.
[47]王淑平,张国山.基于PI控制器的线性系统的鲁棒耗散控制[J].控制与决策,2012,08:1139-1144.
[48]朱琳.生命教育融入大学生思想政治教育研究[D].南京农业大学,思想政治教育,2012,硕士.
[49]江钰.城市化对服务业效率影响的实证研究[D].重庆大学,产业经济学,2014,硕士.
[50]陈智.复合蓄能材料制备及微胶囊溶液换热特性分析[D].南京大学,制冷及低温工程,2013,硕士.